Μοριακή βιολογία του παράγοντα Willebrand

   Εισαγωγή

        Ο παράγοντας Willebrand είναι μια γλυκοπρωτεϊνη του πλάσματος η οποία ουσιαστικά λειτουργεί για τα φυσιολογικά αιμοπετάλια. Ο παράγοντας συντίθεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα μεγακαρυοκύτταρα και ίσως με συγκυτιοτρόπο και ίσως από τα συγκυτιοποβλάστη του πλακούντα. Η βιοσύνθεση του παράγοντα Willebrand είναι εξαιρετικά σύνθετη. Η πρώτη μεταγραφή του παράγωγου είναι ένας πρεπρο Willebrand ένα πρεπρο Willebrand πολυπεπτίδιο 370.000 daltons ύστερα από μετακίνηση ενός πεπτιδίου σημαντόδη ο von Willebrand σχηματίζει διμερή με σουλφιδικούς δεσμούς κοντά στο καρβοξυτελικό άκρο και οι υποομάδες που βοηθούν σε ένα πρωτόμερο των 600.000 και σχηματίζει τελικά υποομάδες, συνδέονται πολλές υποομάδες με την βοήθεια ενός πρωτομερούς της τάξης των 600.000 dalton . Περισσότερο δισουλφιδικοί δεσμοί σχηματίζονται σε μια σειρά ολιγομερών την οποία το πρωτόμερο είναι η βασική επαναλαμβανόμενη μονάδα. Μια περίπου τον ίδιο χρόνο που σχηματίζονται τα ολιγομερή ένα προπεπτίδιο των 100.000 daltons αποκόπτεται από το αζωτοτελικό άκρο όλων σχεδόν των υποομάδων. 'Ετσι ο ώριμος παράγοντας Willebrand είναι ετερογενής είναι μια συλλογή ετερογενής, ολιγομερών τα οποία ποικίλουν από πρωτομερή των 500.000 daltons, που σχηματίζονται από 20 υποομάδες και περίπου και φθάνουν τα 10.000.000 daltons. Επιπρόσθετα μεταγραφικές τροποποιήσεις περιλαμβάνουν την προσθήκη αζωτοτελικό και οξυγόνο αζωτοσυνδεμένου υδρογονάνθρακα και η ενσωμάτωση θείου είναι μια άγνωστη δομή. Ο ώριμος Willebrand αποθηκεύεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα στα μοναδικά οργανίδια που καλούνται σωματίδια. πίσης βρίσκονται τα α σωματίδια των αιμοπεταλίων. Ο παράγοντας Willebrand εκκρίνεται στο πλάσμα όπου σε συγκεντρώσεις 10 περίπου μικρογραμμαρίων / ml και βρίσκεται επίσης στο υπενδοθηλιακό συνδετικό ιστό. Ο παράγοντας Willebrand δεν έχει γνωστή ενζυματική δραστηριότητα αλλά παίρνει μέρος συμμετέχει στην αιμοστατική λειτουργία διαμέσου αντιδράσεων σύνδεσης που παίρνει μέρος. Σχηματίζει γέφυρες μεταξύτης επιφάνειας των αιμοπεταλίων και περιοχές του τραυματισμένου αγγειακού ενδοθηλίου βοηθώντας το σχηματισμό του πρωτοπαθούς αιμοπεταλιακού θρόμβου. Δύο διαφορετική διακριτική υποδοχείς έχουν ταυτοποιηθεί στα αιμοπετάλια. Στα αιμοπετάλια μια γλυκοπρωτεϊνη η ΙΒ φαίνεται να μεσολαβεί στην προσκόλληση των ομαλών των ήρεμων αιμοπεταλίων. Στον ακινητοποιημένο παράγοντα Willebrand στο υπενδοθηλιακό συνδετικό ιστό και ένας υποδοχέας επίσης υπεύθηνος για την σύνδεση και τη ανεξαρτημένη από τον παράγοντα Willebrand συσσώρευση των αιμοπεταλίων η οποία εισάγεται in vitro από το αντιβιοτικό ριστοσετίνη. 'Ενας δεύτερος υποδοχέας το σύμπλεγμα γλυκοπρωτεϊνης 2Β3α των αιμοπεταλίων εκτίθεται στα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια. Μια σημαντική λειτουργία αυτού του συμπλέγματος είναι να μεσολαβεί στη συσσώρευση των αιμοπεταλίων με αντιδράσεις διαμέσου αντιδράσεων στο ινωδογόνο του πλάσματος αυτός ο υποδοχέας επίσης μπορεί να διεγείρει να διευκολύνει την προσκόλληση του εξαρτημένου παράγοντα Willebrand από τα αιμοπετάλια στην επιφάνεια. Μεταξύ αρκετών συστατικών του συνδετικού ιστού το κολλαγόνο έχει επίσης φανερώσει έχει δείξει ότι μπορεί να συνδέει τον παράγοντα Willebrand και να προσφέρει να συμμετέχει στην προσκόλληση των αιμοπεταλίων την εξαρτημένη από τον παράγοντα Willebrand. Η φιμπρονεκτίνη και άλλα μακρομόρια του τοιχώματος των αγγείων μπορεί να συμμετέχει σε αυτή την λειτουργία. Η κληρονομική έλλειψη της λειτουργίας του παράγοντα Willebrand ή η νόσος Willebrand φαίνεται να είναι η πιο κοινή γενετικά μεταδιδόμενη αιμορραγική ασθένεια σε όλον τον κόσμο. Βρειά Willebrand είναι σχεδόν σπάνια και επιρεάζει 1/2 έως 3% στο εκατομύριο την Δυτική Ευρώπη και την Σκανιναθία. Εάν όλες οι περιπτώσεις οι οποίες έτυχαν της προσοχής των ειδικών κέντρων αναφοράς περιλαμβάνοντες η συχνότητα φθάνειτα 125 άτομα στο εκατομύριο. Εντούτοις η ανίχνευση μη επιλεγμένου πληθυσμού σε παιδιά σχολικής ηλικίας στην Ιταλία έδειξε ότι η πραγματική συχνώτητα είναι πλησιάζει τις 8.000 στο εκατομύριο. Είναι φανερό ότι η νόσος είναι μια πολύ ετερογενής ασθένεια.

       Τα τελευταία χρόνια έχει πραγματοποιηθεί μεγάλη πρόοδος στην ομαδοποίηση των νόσων της ετερογένειας της νόσου Willebrand. 'Ετσι σήμερα αναγνωρίζονται δύο μεγάλες υπομάδες της νόσου. Η Willebrand τύπου Ι και Willebrand t;ypoy II. Κάθεμιά από αυτές περιέχει αρκετές διαφορές διακριτές ποικιλίες ίσως δεν είναι πια σε έκπληξη, δεν εκπλήσει το γεγονός ότι η λειτουργία αυτών των σύμπλοκών των σύνθετων μορίων όπως είναι ο Willebrand το μόριο του παράγοντα  Willebrand μπορεί να καταστρέφεται με διάφορους τρόπους όπως με αρκετή ανεξαρτησία μπορεί να εμφανίζεται γενετικές απώλιες οι οποίες αντιτοίθουν στον φαινότυπο της νόσου Willebrand. Προς το παρόν έχει αρχίσει η μελέτη εδώ και αρκετά χρόνια της νόσου Willebrand με τη χρησιμοποίηση μεθόδους ανασυνδιασμένου DNA . Οι σχετικές χαμηλές συγκεντρώσεις του παράγοντα στο πλάσμα φαίνεται να εμποδίζουν τις μεθόδους καθαρισμούς του και η ποσότητα της πρωτεϊνης να μην είναι αρκετή και να μην επιτρέπει την πλήρη δομική ταυτοποίηση με χαμηλές μεθόδους με πρωτεϊνικές μεθόδους. Το μόριο των υπομονάδων είναι πολύ μεγάλο που πιο σύνθετο και μπερδεμένο και δύσκολα περιορίζεται η δομική αλληλουχία της πρωτεϊνης. Επιπλέον είναι σύνθετη και δύσκολη η μεταγραφική διαδικασία για τον παράγοντα φανερώνοντας ότι η δομή που υπάρχει στο ώριμο πρωτεϊνη του πλάσματος μπορεί μόνο σε ένα μέρος της να είναι μέρος του πρόδρομου και η γνώση ότι η δομή του προδρόμου μορίου βοηθάει στο να προσχεδιαστούν για τους τρόπους και τους συνδυασμούς οδηγούν των πολυμερών. Η πρόδρομη δομή είχε θεωρηθεί προφανής από την πλήρη αλληλουχία του cDNA. 'Ετσι το cDNA απομονώνεται θα μπορούσε να σχηματισθεί μια αλληλουχία του γονιδίου δομής και επίσης να προσδιρισθεί το μόριο το βασικό μόριο του παράγοντα Willebrand. Να προσδιορισθεί η μοριακή βάση της νόσου Willebrand. Αρκετές από αυτές τις αρχικές σκέψεις έχουν επιβεβαιωθεί.

            Απομόνωση των κλώνων cDNA για τον ανθρώπινο

                                         Willebrand  

    Ο και οι συνεργάτες του το 1982 κατάφεραν να προσδιορίσουντην αλληλουχία του ανθρώπινου παράγοντα Willebrand με μεθόδους χημείας των πρωτεϊνών. Η πλήρη πρωτοταγής δομή είχε υποτεθεί ότι έπαιρνε λίγο θα έπαιρνε κάποιο χρόνο και ότι συμπληρωματική προσπέλαση με την κλωνοποίηση του DNA θα διασαφήνιζε τη δυναμική της αλληλουχίας των αμινοξέων και θα εγκαθιστούσε μια μεταξύ των πεπτιδίων. Επιπλέον η cDNA αλληλουχία θα μπορούσε επίσης να προείπει τις σχέσεις μεταξύ προδρόμων και τελικών υπομονάδων. 'Ετσι αποφασίστηκε να ληφθούν κλώνοι cDNA ταυτόχρονα επειδή ο παράγοντας Willebrand συντίθεται στο ενδοθήλιο αποφασίστηκε η κατασκευή μιάς DNA βιβλιοθήκης χρησιμοποιώντας πολύ και RNA και καλλιέργειας ομφαλικής φλέβας ενδοθηλιακών κυττάρων. Καλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων από ομφαλική φλέβα έχει επιλεγεί ως στο ΛΖΤ 11 το οποίο τον ίδιο καιρό με μια καινούργια τεχνολογία είχε δείξει ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί από τους. Με αυτόν τον  το cDNA εισήγαγε ή κομμάτια μπορούσαν ακόμα να κλωνοποιηθεί σε Escherichia coli  και σε γονίδια β-γαλακτοξυδάσης οι οποίες ήταν υπό έλγχο από αυτό από έναν κατασταλτή. Η μεταγραφή αυτού του μπορούσε να εισάγει με ανάλογγ γαλακτόζης όπως είναι η ισοπροπυλ-θείο βήτα γαλακτοσίδη. Εάν το προστιθέμενο cDNA ήταν σεσωστό προσανατολισμό και εύκολα αναγνώσιμο το αποτέλεσμα mRNA μπορούσε να μεταφρασθεί σε μια δεδομένη για να δώσει μία πρωτεϊνη η οποία θα περιείχε αλληλουχίες ανθρώπινες πρωτεϊνης προσκολλημένες σε άνθρακα τελικό άκρο ενός μεγάλου τμήματος β-γαλακτοσιδάσης. Οι κλώνοι εξέφραζαν ένα μέρος από αυτήν την ανθρώπινη πρωτεϊνη που ενδιέφεραι και μπορούσε να ταυτοποιηθεί με ανάλογα αντισώματα. Η στρατιγική ήταν: α) να παρθούν κλώνοι με αντισώματα μ και να χρησιμοποιηθούν ως πληροφορίες στην αλληλουχία των πρωτεϊνών για να επιβεβαιωθεί η ταυτότητα των κλώνων. Χρησιμοποιώντας ιώδιο 125 για τη σύμβαση των αντισωμάτων κατά του παράγοντα Willebrand έγινε καθαρίστηκαν από με ιώδιο σημασμένα αντισώματα καθαρίστηκαν με χρωματογραφία συγγένειας του παράγοντα Willebrand ελέχθηκαν περίπου σε 2.5 εκ. ανασυνδυασμένα ανάλογα. Δύο από αυτά απομονώθηκαν στο ΛΗ von Willebrand factor 1 και LH von Willebrand factor III, ανθρώπινης δηλ. παράγοντα ΙΙΙ τα οποία ταυτοποιήθηκαν και στη συνέχεια έδειξαν να κωδικοποιούν ανθρώπινο παράγοντα Willebrand με σύγκριση μεταφρασμένης cDNA ακολουθίας με πρωτεΙνες με προγενικές αλληλουχίες οι οποίες προσδιορίστηκαν ανεξάρτητα. Αυτές οι απομονωμένα μόρια περιέχουν ένα συνολικό αριθμό από 5,1 Κιλομπάσεων cDNA αλληλουχίες συν μια πολυ περιφέρεια από 150 νουκλεοτίδια που συγκρίνεται προς 8.5 -9 Κιλομπάσεις mRNA ταυτοποιημένου με την τεχνική. Τρεία άλλα εργαστήρια , δύο της Βοστώνης και ένα του Αμστερντάμ επίσης δημοσίευσαν ουσιαστικά ταυτόχρονες μελέτες απομόνωσεις μερικού cDNA που κλώνων cDNA ανθρώπινου παράγοντα Willebrand. Το υπόλοιπο από τις αλληλουχίες του cDNA μπορούσε συνεπώς κατ'ακολουθία να απομονωθεί χρησιμοποιώντας μερικές ενσωματώσεις cDNA και τον επανέλεγχο της cDNA βιβλιοθήκης με υβριδοποίηση, βοηθώντας έτσι στη συλλογή ενός cDNA τα οποία μαζί με τον μπορούσαν να σχηματίσουν ολόκληρη την αλληλουχία του mRNA του παράγοντα Willebrand.